Inaktywacja mutacji PAPSS2 u pacjenta z przedwczesnym Pubarche czesc 4

Przeprowadzono analizę Western blot19 z użyciem poliklonalnego przeciwciała ludzkiego do GST (Amersham). Dzikie i zmutowane białka PAPSS2 inkubowano z ludzkim białkiem SULT2A1 typu dzikiego w celu zmierzenia zdolności PAPSS2 do ułatwiania sulfonowania DHEA do DHEAS. Wykonywano ekstrakcję steroidową i oznaczano ilościowo jak opisano wcześniej. Wszystkie testy przeprowadzono w trzech niezależnych potrójnych doświadczeniach; dane są podawane jako średnie (. SE). Dalsze szczegóły dotyczące testu funkcjonalnego podano w Dodatku Uzupełniającym. Wyniki
Sekwencjonowanie DNA
Rysunek 1. Rysunek 1. Lokalizacja i sekwencjonowanie mutacji PAPSS2. Panel A pokazuje lokalizację mutacji zidentyfikowanych w genie kodującym syntazę PAPS 2 (PAPSS2) i dwie funkcjonalne domeny białka PAPSS2. Pacjent (P) był złożoną heterozygotą dla mutacji, podczas gdy ojciec (F) i matka (M) byli nosicielami heterozygotycznymi. Panel B pokazuje krzyżowe dopasowanie regionu PAPSS2 zawierającego mutację missense T48R i zapewnia schematyczne przedstawienie ich odpowiednich struktur białkowych. Panel C pokazuje wyniki analizy polimorfizmu długości łańcuchów polimerazy-długości fragmentów (PCR-RFLP) mutacji PAPSS2 zidentyfikowanych przez bezpośrednie sekwencjonowanie, które potwierdzają, że pacjent i jej ojciec byli heterozygotycznymi nosicielami c.143C . Mutacja punktowa G daje T48R, a pacjentka i jej matka niosły heterozygotyczną mutację C.985C . T powodującą mutację nonsensowną R329X. Kontrolne DNA zostało potwierdzone jako dziki poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie. (Dopasowania sekwencji białka przedstawione w panelu B uzyskano przy użyciu ClustalX2 [www.clustal.org] i zdeponowanych sekwencji dla PAPSS2 u ludzi [numer dostępu w GenBank NP_004661], myszy [NP_035994], drożdży [CAA46252 i CAA60932. ], bakterie [A1AEU4 i AAG57859] oraz rośliny [CAA53426 i CAB78510].)
Przypuszczając, że równoczesny nadmiar androgenów i bardzo niskie poziomy DHEAS można wyjaśnić defektem w siarczanowaniu DHEA, zsekwencjonowaliśmy geny kodujące kluczowe enzymy układu siarczanowania DHEA-DHEAS. Nie wykryto mutacji w SULT2A1 lub PAPSS1. Jednak bezpośrednie sekwencjonowanie genu PAPSS2 ujawniło heterozygotyczne podstawienie cytozyny dla guaniny w pozycji nukleotydowej 143 (c.143C . G; g.49,330C . G) w eksonie 2 PAPSS2 u pacjenta i jej ojca. Ta mutacja missense zastępuje argininę na treoninę w pozycji 48 białka PAPSS2 (T48R). Ta reszta znajduje się w domenie kinazy adenozyno-5 -fosfosiarczanowej (APS) enzymu i jest wysoce konserwatywna dla różnych gatunków (Figura 1). Ponadto, sekwencjonowanie ujawniło heterozygotyczne podstawienie cytozyny dla tymidyny w komplementarnym DNA (cDNA) w pozycji 985 (c.985C . T, g.67,422C . T) w eksonie 8 PAPSS2 u pacjenta i jej matki, wprowadzając przedwczesny kodon stopu. przewiduje się, że skróci białko w pozycji 329 (R329X), tym samym zaburzając domenę sulfurylazy ATP PAPSS2 (Figura 1A).
Analiza PCR-RFLP potwierdziła dwie mutacje zidentyfikowane przez bezpośrednie sekwencjonowanie (Figura 1C). Nie stwierdzono mutacji w bezpośrednim sekwencjonowaniu eksonów 2 i 8 PAPSS2 w 200 kontrolach, w tym 100 osób tureckich, wykluczając w ten sposób możliwość, że zidentyfikowane mutacje reprezentują warianty sekwencji specyficzne dla populacji.
Ekspresja mRNA
Rysunek 2
[patrz też: frezy do paznokci, pokrowce antyroztoczowe, Usuwanie blizn ]

Powiązane tematy z artykułem: frezy do paznokci pokrowce antyroztoczowe Usuwanie blizn